Faktor gangguan dina réaksi PCR

Salila réaksi PCR, sababaraha faktor interfering mindeng kapanggih.
Kusabab sensitipitas PCR anu luhur pisan, kontaminasi dianggap salah sahiji faktor anu paling penting anu mangaruhan hasil PCR sareng tiasa ngahasilkeun hasil positip palsu.
Sarua kritis nyaéta rupa-rupa sumber anu ngakibatkeun hasil négatip-palsu. Upami salah sahiji atanapi langkung bagian penting tina campuran PCR atanapi réaksi amplifikasi sorangan dihambat atanapi diganggu, tés diagnostik tiasa ngahalangan. Ieu bisa ngakibatkeun ngurangan efisiensi komo hasil négatip palsu.
Salian inhibisi, leungitna integritas asam nukléat target bisa lumangsung alatan pengiriman barang jeung/atawa kaayaan gudang saméméh persiapan sampel. Khususna, suhu anu luhur atanapi panyimpen anu teu cekap tiasa nyababkeun karusakan sél sareng asam nukléat. Fiksasi sél sareng jaringan sareng parafin émbedding mangrupikeun panyabab fragméntasi DNA sareng masalah anu terus-terusan (tingali Gambar 1 sareng 2). Dina kasus ieu, malah isolasi optimal sarta purifikasi moal mantuan.

Gambar 1 | Pangaruh imobilisasi dina integritas DNA
Éléktroforésis gél agarose nunjukkeun yén kualitas DNA anu diisolasi tina bagian parafin tina autopsi béda-béda. DNA tina panjang fragmen rata-rata anu béda-béda aya dina ekstrak gumantung kana metode fiksasi. DNA dilestarikan ngan lamun dibereskeun dina sampel beku asli jeung dina formalin nétral buffered. Pamakéan asam kuat Bouin fixative atawa unbuffered, formalin ngandung asam format nyababkeun leungitna signifikan DNA. Fraksi sésana téh kacida fragmented.
Di kénca, panjang fragmen dinyatakeun dina pasangan kilobase (kbp)

Gambar 2 | Leungitna integritas target asam nukléat
(a) Gap 3′-5′ dina duanana untaian bakal ngakibatkeun putus dina DNA target. sintésis DNA masih bakal lumangsung dina sempalan leutik. Sanajan kitu, lamun situs anil primer leungit dina fragmen DNA, ngan amplifikasi linier lumangsung. Dina kasus nu paling nguntungkeun, fragmen bisa resaturate silih, tapi ngahasilkeun bakal leutik tur handap tingkat deteksi.
(b) Leungitna basa, utamana alatan depurinasi jeung formasi dimer timidin, ngabalukarkeun panurunan dina jumlah beungkeut H jeung panurunan dina Tm. Salila fase pemanasan elongated, primers bakal ngalembereh jauh ti DNA matriks sarta moal anneal sanajan dina kaayaan kirang stringent.
(c) Basa timin anu padeukeut ngabentuk dimer TT.
Masalah umum sejen anu mindeng lumangsung dina diagnostics molekular nyaéta kurang-ti-optimal sékrési asam nukléat target dibandingkeun ékstraksi fénol-kloroform. Dina kasus ékstrim, ieu bisa pakait sareng négatip palsu. Seueur waktos tiasa dihémat ku ngagolakkeun lisis atanapi nyerna énzimatik lebu sél, tapi metode ieu sering nyababkeun sensitipitas PCR rendah kusabab sékrési asam nukléat teu cekap.

Inhibisi kagiatan polimérase nalika amplifikasi

Sacara umum, inhibisi dianggo salaku konsép wadah pikeun ngajelaskeun sagala faktor anu nyababkeun hasil PCR suboptimal. Dina harti biokimiawi ketat, inhibisi diwatesan ku aktivitas énzim, nyaéta, ngurangan atawa nyegah konversi substrat-produk ngaliwatan interaksi jeung situs aktip DNA polimérase atawa kofaktor na (misalna Mg2+ pikeun Taq DNA polymerase).
Komponén dina sampel atawa rupa-rupa panyangga jeung ékstrak nu ngandung réagen bisa langsung ngahambat énzim atawa bubu kofaktorna (misalna EDTA), ku kituna nganonaktipkeun polimérase sarta dina gilirannana ngabalukarkeun turunna atawa hasil PCR négatip palsu.
Nanging, seueur interaksi antara komponén réaksi sareng asam nukléat anu ngandung udagan ogé ditunjuk salaku 'sambetan PCR'. Sakali integritas sél kaganggu ku isolasi jeung asam nukléat dileupaskeun, interaksi antara sampel jeung solusi sabudeureun na jeung fase padet bisa lumangsung. Contona, 'pemulung' bisa ngabeungkeut DNA untai tunggal atawa ganda ngaliwatan interaksi non-kovalén sarta ngaganggu isolasi jeung purifikasi ku cara ngurangan jumlah target nu antukna ngahontal wadah réaksi PCR.
Sacara umum, sambetan PCR aya dina kalolobaan cairan awak sareng réagen anu dianggo pikeun tés diagnostik klinis (uréa dina cikiih, hémoglobin sareng heparin dina getih), suplemén dietary (komponén organik, glikogén, lemak, ion Ca2+) sareng komponén di lingkungan (fénol). , logam beurat)

Inhibitor PCR anu langkung umum tiasa dipendakan dina baktéri sareng sél eukariot, DNA non-target, makromolekul DNA-mengikat tina matriks jaringan sareng alat laboratorium sapertos sarung tangan sareng plastik. Pemurnian asam nukléat salami atanapi saatos ékstraksi mangrupikeun metode anu dipikaresep pikeun ngaleungitkeun sambetan PCR.
Kiwari, rupa-rupa parabot ékstraksi otomatis bisa ngaganti loba protokol manual, tapi 100% recovery jeung/atawa purifikasi tina target geus kungsi kahontal. Sambetan poténsial masih tiasa aya dina asam nukléat anu dimurnikeun atanapi tiasa dianggo. Aya sababaraha strategi pikeun ngirangan pangaruh inhibitor. Pilihan polimérase anu pas tiasa gaduh pangaruh anu signifikan dina kagiatan inhibitor. Métode séjén anu kabuktian pikeun ngirangan inhibisi PCR nyaéta ningkatkeun konsentrasi polimérase atanapi nerapkeun aditif sapertos BSA.
Inhibisi réaksi PCR tiasa dibuktikeun ku ngagunakeun kontrol kualitas prosés internal (IPC).
Kudu ati-ati pikeun miceun sadaya réagen sareng solusi sanés dina kit ékstraksi, sapertos étanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol sareng fénol, tina isolat asam nukléat ku léngkah cuci lengkep. Gumantung kana konsentrasina, aranjeunna tiasa ngaktifkeun atanapi ngahambat PCR.