Faktor gangguan dina réaksi PCR

Salila réaksi PCR, sababaraha faktor anu ngaganggu sering kapanggih.
Kusabab sensitivitas PCR anu luhur pisan, kontaminasi dianggap salaku salah sahiji faktor anu paling penting anu mangaruhan hasil PCR sareng tiasa ngahasilkeun hasil anu positif palsu.
Anu teu kalah pentingna nyaéta rupa-rupa sumber anu nyababkeun hasil négatif palsu. Upami hiji atanapi langkung bagian penting tina campuran PCR atanapi réaksi amplifikasi sorangan dihambat atanapi kaganggu, uji diagnostik tiasa kahambat. Ieu tiasa nyababkeun efisiensi anu turun sareng bahkan hasil négatif palsu.
Salian ti inhibisi, leungitna integritas asam nukléat target tiasa kajantenan kusabab kaayaan pengiriman sareng/atanapi panyimpenan sateuacan persiapan sampel. Khususna, suhu anu luhur atanapi panyimpenan anu teu cekap tiasa nyababkeun karusakan sél sareng asam nukléat. Fiksasi sél sareng jaringan sareng panyisipan parafin mangrupikeun panyabab fragmentasi DNA anu dipikanyaho sareng masalah anu terus-terusan (tingali Gambar 1 sareng 2). Dina kasus ieu, bahkan isolasi sareng purifikasi anu optimal moal ngabantosan.

Gambar 1 | Pangaruh imobilisasi kana integritas DNA
Éléktroforésis gél agarosa némbongkeun yén kualitas DNA anu diisolasi tina bagian parafin autopsi rupa-rupa pisan. DNA kalayan panjang fragmen rata-rata anu béda-béda aya dina ékstrak gumantung kana metode fiksasi. DNA ngan ukur diawétkeun nalika difiksasi dina sampel beku asli sareng dina formalin nétral anu di-buffer. Panggunaan fiksatif Bouin anu asam pisan atanapi formalin anu henteu di-buffer, anu ngandung asam format nyababkeun leungitna DNA anu signifikan. Fraksi sésana fragméntasi pisan.
Di kénca, panjang fragmen dinyatakeun dina pasangan kilobase (kbp)

Gambar 2 | Leungitna integritas target asam nukléat
(a) Celah 3′-5′ dina dua untaian bakal nyababkeun pegatna DNA target. Sintésis DNA bakal tetep lumangsung dina fragmen leutik. Nanging, upami situs annealing primer leungit dina fragmen DNA, ngan ukur amplifikasi linier anu lumangsung. Dina kasus anu paling nguntungkeun, fragmen-fragmen éta tiasa silih jenuh, tapi hasilna bakal alit sareng di handap tingkat deteksi.
(b) Leungitna basa, utamana alatan depurinasi jeung formasi dimer timidin, ngabalukarkeun panurunan jumlah beungkeut-H sarta panurunan Tm. Salila fase pemanasan anu manjang, primer bakal lebur tina DNA matriks sarta moal anneal sanajan dina kaayaan anu kirang ketat.
(c) Basa timin anu padeukeut ngabentuk dimer TT.
Masalah umum anu sering kajadian dina diagnostik molekuler nyaéta pelepasan asam nukléat target anu kirang optimal dibandingkeun sareng ékstraksi fenol-kloroform. Dina kasus anu ekstrim, ieu tiasa dikaitkeun sareng hasil négatif palsu. Seueur waktos anu tiasa dihémat ku cara ngagolak lisis atanapi pencernaan énzimatik tina sésa-sésa sél, tapi metode ieu sering nyababkeun sensitivitas PCR anu handap kusabab pelepasan asam nukléat anu teu cekap.

Inhibisi aktivitas polimérase nalika amplifikasi

Sacara umum, inhibisi dianggo salaku konsép wadah pikeun ngajelaskeun sadaya faktor anu ngarah kana hasil PCR suboptimal. Dina harti biokimia anu ketat, inhibisi diwatesan ku aktivitas énzim, nyaéta, éta ngirangan atanapi nyegah konvérsi produk substrat ngalangkungan interaksi sareng situs aktif DNA polimérase atanapi kofaktorna (contona, Mg2+ pikeun Taq DNA polimérase).
Komponén dina sampel atanapi rupa-rupa buffer sareng ekstrak anu ngandung réagen tiasa langsung ngahambat énzim atanapi néwak kofaktorna (contona EDTA), sahingga nganonaktipkeun polimérase sareng antukna nyababkeun hasil PCR anu turun atanapi négatip palsu.
Nanging, seueur interaksi antara komponén réaksi sareng asam nukléat anu ngandung target ogé ditunjuk salaku 'inhibitor PCR'. Sakali integritas sél kaganggu ku isolasi sareng asam nukléat dileupaskeun, interaksi antara sampel sareng larutan sakurilingna sareng fase padet tiasa kajantenan. Salaku conto, 'pembuang' tiasa ngabeungkeut DNA untaian tunggal atanapi ganda ngalangkungan interaksi non-kovalén sareng ngaganggu isolasi sareng purifikasi ku cara ngirangan jumlah target anu pamustunganana ngahontal wadah réaksi PCR.
Sacara umum, inhibitor PCR aya dina kalolobaan cairan awak sareng réagen anu dianggo pikeun tés diagnostik klinis (uréa dina cikiih, hémoglobin sareng heparin dina getih), suplemén dietary (komponén organik, glikogén, lemak, ion Ca2+) sareng komponén dina lingkungan (fénol, logam beurat)

Inhibitor PCR anu langkung nyebar tiasa dipendakan dina baktéri sareng sél eukariotik, DNA non-target, makromolekul anu ngabeungkeut DNA tina matriks jaringan sareng alat laboratorium sapertos sarung tangan sareng plastik. Pemurnian asam nukléat salami atanapi saatos ékstraksi mangrupikeun metode anu langkung dipikaresep pikeun miceun inhibitor PCR.
Ayeuna, rupa-rupa alat ékstraksi otomatis tiasa ngagentos seueur protokol manual, tapi pamulihan 100% sareng/atanapi purifikasi target teu acan pernah kahontal. Inhibitor poténsial tiasa masih aya dina asam nukléat anu dimurnikeun atanapi panginten parantos aya pangaruhna. Aya strategi anu béda pikeun ngirangan dampak inhibitor. Pilihan polimérase anu pas tiasa gaduh dampak anu signifikan kana aktivitas inhibitor. Métode anu kabuktian sanés pikeun ngirangan inhibisi PCR nyaéta ningkatkeun konsentrasi polimérase atanapi nerapkeun aditif sapertos BSA.
Inhibisi réaksi PCR tiasa didemonstrasikeun ku panggunaan kontrol kualitas prosés internal (IPC).
Kudu ati-ati dina miceun sadaya réagen sareng larutan sanés dina kit ékstraksi, sapertos étanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol sareng fenol, tina isolat asam nukléat ku léngkah ngumbah anu saksama. Gumantung kana konsentrasina, éta tiasa ngaktipkeun atanapi ngahambat PCR.